神经干细胞移植—脑血管疾病治疗的希望
【摘要】 目的 进一步探讨脑血管疾病切实有效的治疗方法。论点 神经干细胞移植打破了生物体内脑细胞不能再生的神话，给“不可逆性脑损害”的修复与功能再带来了希望。论据 目前脑血管疾病的治疗，无论是溶栓治疗还是介入微创治疗，都是力求恢复血供，保护处于“半暗带”的神经元，但都不能从根本上阻断脑损伤的发生或促使受损脑组织再生。因此，能够替代缺损的神经功能而达到“无后遗症”才是治疗的最终目标。而神经干细胞能通过其潜在的自我修复功能使受损的脑组织得以新生。结论神经干细胞移植在治疗脑血管疾病方面可能存在巨大潜能，但要达到临床应用可能还有很长的路要走。
关键词 神经干细胞 脑血管疾病
一直以来，脑血管疾病造成的神经细胞死亡没有切实有效的治疗方法，留下无法恢复的神经缺损，给患者及家庭带来极大的痛苦。虽然，国内外研究人员从溶栓治疗到介入微创治疗，力求恢复血供，保护处于“半暗带”的神经元。但是目前缺血性卒中的诸多治疗仍然是临床治疗的主要手段，都不能阻断脑损伤的发生或促使受损脑组织再生。因此，能够替代缺损的神经功能而达到“无后遗症”才是治疗的最终目标。1992年Reynolds等根据实验研究首次提出“神经干细胞(neural stem cell，NSC)”概念，打破了生物体内脑细胞不能再生的神话。这给苦无良策的“不可逆性脑损害”的修复与功能再现带来了希望。近年来，随着NSC研究的深入，已经有明确证据表明，不仅胚胎期未成熟的神经组织，而且成人CNS(central neuron system，CNS)的特定部位也存在NSC [1] ，这些特定部位的NSC在特定条件下具有再生能力，脑血管疾病有望通过激活内源性NSC的增殖或植入外源性NSC进行修复。
1 NSC与CNS的再生与修复
NSC是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。以往的观点认为，成年哺乳动物CNS的神经再生非常有限，而且随着年龄的增长，神经元数量会逐渐减少。然而近20年的研究表明，成年哺乳动物CNS内仍然存在神经发生。目前已明确的部位有海马齿状回、室管膜下区 [2，3] 。已有研究发现，在缺血缺氧条件下位于室管膜下区、海马和脉络膜丛等部位的内源性NSC可发生增殖、迁移并分化为神经元和神经胶质细胞，因而提示中枢神经系统可通过自身内源性干细胞来修复，只是由于条件不足而没有足够的新生细胞。最近的研究证实，这些原始NSC数量稀少，且处于静止状态，缺乏特异性形态、表面标志和分化抗原，至今也不能高度纯化分离，很难克隆化4]。因此，外源性NSC移植提供给我们一个大胆的新思路。许多研究表明，NSC移植物在宿主CNS内具有明显的生存、迁移和分化能力，由人胎脑分离的NSC在植入胚胎或新生鼠脑内后，表现为在宿主脑内迁移并进行区域特异性分化，若将相同的人胎脑NSC植入成年大鼠室管膜下区，它们沿吻侧迁移流迁移入嗅球，分化为双极神经元，其分化命运与存留于室管膜下区的内源性NSC相同 [5]。从成年哺乳动物CNS分离的NSC也具有较强的分化潜能，而决定NSC分化命运的主要因素除局部微环境外，还包括NSC的内在特性。如成年动物脊髓NSC植入海马齿状回，能分化为神经元;若植入成年大鼠脊髓则不分化为神经元 [6] ;将从成年动物海马齿状回获得的NSC植入成年大鼠室管膜下区或迁移流后，能分化为嗅球神经元;若植入成年大鼠海马，则产生新的海马神经元 [7，8] 。无论胚胎或成人NSC，在移植入成人CNS非神经发生区后大部分都分化成神经胶质细胞。外源性CSN移植取得了令人鼓舞的成果。Modo等 [9] 给局灶性缺血大鼠移植MHP36鼠干细胞，结果表明，移植的干细胞可增殖分化成神经元细胞，并能显著促进神经功能恢复;Zhang等 [10] 的研究发现，静脉注射骨髓间质细胞可进入脑梗死后的脑实质，并促进新生血管形成。进一步的研究表明，移植的干细胞和骨髓间质细胞可通过分泌生长因子促进内源性神经元再生，促使神经功能恢复。于炳新等 [11] 给局灶性脑缺血大鼠注射重组人粒细胞集落刺激因子，动员自体骨髓造血干细胞。结果表明，脑实质内表达SYN和MAP-2蛋白的增殖细胞显著增加，神经功能缺损明显改善。因此认为，除通过骨髓间质细胞机制外，同时也可能存在骨髓干细胞脑实质内转移，但尚待进一步的研究。
2 转基因技术与NSC
NSC的增殖、分化受自身基因和外来信号(如生长因子)的调控，外来信号首先要与NSC表面的受体相结合，才能将这些信号传至细胞内，从而引起一些与增殖分化相关的基因转录和蛋白质表达。因此，调控外源性NSC的增殖和分化是移植成功并发挥功能的关键。目前可通过转基因技术调控NSC的分化和增殖。将基因导入体外培养的NSC，可用来治疗相应的CNS疾病，其主要目的一是通过导入特定基因调控NSC的增殖和分化;二是通过导入特定基因使NSC定向分化为用于移植治疗所需的特定细胞或表达所需的神经营养因子。NSC可作为理想的基因载体，根据疾病的不同，考虑需要什么部位和具有哪种扩散程度的细胞。目前已采用这一方法进行了部分动物实验。Lacoˉrazza等对Tay-sachs等模型小鼠(先天性脂质代谢异常综合征)将β-氨基己糖苷酯酶α亚单位基因导入C17.2干细胞株进行移植治疗 [12]，该种细胞在植入胚胎鼠和新生鼠脑室后4周，即可发现治疗水平的人β-氨基己糖苷酯酶α在小鼠脑内稳定表达。
3 神经营养因子与NSC
为增强NSC移植后在宿主脑内的功能，近期的研究已不再限于单纯NSC移植。用神经营养因子修饰的NSC移植成为研究热点。由于这些因子本身即可促进神经元成活，因此可延长NSC的成活时间并促进其分化 [13] 。脑源性神经营养因子(BDNF)对NSC的增殖、分化、成活、迁移和脑损伤后NSC的激活等方面具有重要作用，提示通过其他手段增加内源性BDNF合成、释放或通过转染BDNF的NSC移植入宿主缺血坏死的脑区，可通过BDNF的分泌达到优于单纯干细胞移植的目的。
4 NSC移植的影响因素
成功移植NSC不仅要有效控制NSC的分化、增殖，而且要求被移植的细胞在移植部位能成活下来。影响其成活的因素非常多，如分离、纯化、培养过程中的机械损伤、缺氧、缺血或各种必需生长因子的剥夺等，均可影响移植细胞的成活能力与分化潜能;移植区局部微环境中引起神经细胞死亡的各种病理因素，如兴奋性氨基酸毒性、自由基和酸中毒等同样威胁着移植细胞的成活;因此，除了研究避免移植前细胞损伤的保护措施外，深入研究清除移植区的有害因素，造就适合移植NSC的生存环境更为重要。
5 NSC移植的质疑性研究
在利用NSC移植治疗脑血管疾病的研究越来越引起世界各国医生关注的同时，我们也应看到，近两年来，国外一些研究者报道了一系列对NSC移植前期研究结果的质疑性研究。 较早的研究认为，骨髓间质干细胞(mesenchy-mal stem cell，MSC)在体外长期培养的过程中，能始终保持其多向分化潜能，在特定的条件下可分化为多种间质组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞等。因为来源于骨髓的MSC取材容易，便于自体移植，被认为是一种理想的组织工程干细胞。但最近的一系列研究也对此提出了质疑。美国Terada等 [14] 在体外将含有造血干细 胞的骨髓细胞与胚胎干细胞一起培养，产生了预想不到的肌细胞、肝细胞和神经细胞等细胞表型，提示骨髓可能包含有多能干细胞，或在某些条件下可转化为多能干细胞的干细胞;在体外培养一段时间后加入嘌呤毒素(puromycin)以移除胚胎干细胞。但仍可获得胚胎干细胞样细胞，并可进一步分化出多种形态的表型。基因分析显示，这种胚胎干细胞样细胞的基因型是骨髓细胞和胚胎干细胞的混合基因型。这些发现提示，胚胎干细胞与造血干细胞共同培养时，造血干细胞能自发地与胚胎干细胞融合，诱导造血干细胞分化为胚胎样干细胞，呈现为胚胎干细胞的表型特征与相应功能。由此可以认为，已报道的成年组织干细胞分化为与发育上无关的其他系列细胞类型也是这种融合所致。最近美国的Castro和Wagers等 [15，16] 的研究进一步证实，骨髓干细胞在体内不能分化为神经细胞。
6 小结
神经干细胞移植已引起越来越多学者的关注。NSC移植不是对抗神经病变的病理过程，而是通过其潜在的自我修复功能使受损组织得以新生。尽管近年来有些研究对成年组织干细胞可分为其他组织细胞是否定的结果，这并不意味着干细胞疗法研究的终结。至少告诉我们，无论是对胚胎干细胞还是对成年组织干细胞，人们的认识仅仅是初步的。虽然NSC移植在治疗脑血管疾病方面可能存在巨大潜能，但要达到临床应用还有很长的路要走。
参考文献
1 Pincus DW，Keyoung HK，Harrison-Restelli C，et al.Fibroblast growth factor-2/brain-derived neurotrophic tor-associated maturation of new neurons generated from adult human subependymal cells.Ann Neuˉrol，1998，43:576-585.
2 Gross CG.Neurogenesis in the adult brain:death of a dogma.Nat Rev Neurosci，2000，1:67-73.
3 Rietze R，Poulin P，Weiss S.Mitotically active cells that generate neuˉrons and astrocytes are present in multiple regions of the adult mouse hippocampus.J Comp Neurol，2000，424:397-408.
4 Rossi F，Cattaneo E.Opinion:neural stem cell tehrapy for neurological diseases:dreams and reality.Nat Rev Neurosci，2002，3:401-409.
5 Fricker RA，Carpenter MK，Winkler C，et al.Site-specific migration and neuronal differentiation of human neural progenitor cells after transˉplantation in the adult rat brain.J Neurosci，1999，19:5990-6005.
6 Shihabuddin LS，Horner PJ，Ray J，et al.Adult spinal cord stemcells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.J Neuˉrosci，2000，20:8727-8735.
7 Suhonen JO，Peterson DA，Ray J，et al.Differentiation of adult hipˉpocampus-derived progenitors into olfactory neurons in vivo.Nature，1996，383:624-627.
8 Gage FH，Coates PW，Palmer TD，et al.Survival and differentitation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:11879-11883.
9 Modo M，Stronemer P，Tang E，et al.Effects of implantation site of stem cell grafts on behavioral recovery from stroke damages.Stroke，2002，33:2270-2278.
10 Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.Bone marrow derived endothelial progenitor cells participate in cerebral lariazation after focal cerebral ischemia in the adult mouse.Circ Res，2002，90:284-288.
11 于炳新.重组人粒细胞集落刺激因子在实验性脑缺血中的神经保护作用的初步研究[学位论文].上海:复旦大学附属华山医院神经病学研究所，2003.
12 Magavi SS，Leavitt BR，Macklis JD.Induction of neurogenesis In the neocortex of adult mice.Nature，2000，405:951-955.
13 Andsberg G，Kokaia Z，Bjorklund A，et al.Amelioration of ischemia inˉduced neural death in the rat striatum by NGF-secretingneural stem cells.Eur J Neurosici，1998，10:2026-2036.
14 Terada N，Hamazaki T，Oka M，et al.Bone marrow cells adopt the pheˉ notype of other cells by spontaneous cell fusion.Nature，2002，416:542 -545.
15 Castro RF，Jackson KA，Goodell MA，et al.Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo.Science，2002，297:1299.
16 Wagers AJ，Sherwood RI，Christensen JL，et al.Little evidence for deˉvelopmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.Science，2002，297:2256-2259.
作者单位:300456天津港口医院神经内科
(编辑李 木), 百拇医药(张东菊)
关键词 神经干细胞 脑血管疾病
一直以来，脑血管疾病造成的神经细胞死亡没有切实有效的治疗方法，留下无法恢复的神经缺损，给患者及家庭带来极大的痛苦。虽然，国内外研究人员从溶栓治疗到介入微创治疗，力求恢复血供，保护处于“半暗带”的神经元。但是目前缺血性卒中的诸多治疗仍然是临床治疗的主要手段，都不能阻断脑损伤的发生或促使受损脑组织再生。因此，能够替代缺损的神经功能而达到“无后遗症”才是治疗的最终目标。1992年Reynolds等根据实验研究首次提出“神经干细胞(neural stem cell，NSC)”概念，打破了生物体内脑细胞不能再生的神话。这给苦无良策的“不可逆性脑损害”的修复与功能再现带来了希望。近年来，随着NSC研究的深入，已经有明确证据表明，不仅胚胎期未成熟的神经组织，而且成人CNS(central neuron system，CNS)的特定部位也存在NSC [1] ，这些特定部位的NSC在特定条件下具有再生能力，脑血管疾病有望通过激活内源性NSC的增殖或植入外源性NSC进行修复。
1 NSC与CNS的再生与修复
NSC是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞，它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。以往的观点认为，成年哺乳动物CNS的神经再生非常有限，而且随着年龄的增长，神经元数量会逐渐减少。然而近20年的研究表明，成年哺乳动物CNS内仍然存在神经发生。目前已明确的部位有海马齿状回、室管膜下区 [2，3] 。已有研究发现，在缺血缺氧条件下位于室管膜下区、海马和脉络膜丛等部位的内源性NSC可发生增殖、迁移并分化为神经元和神经胶质细胞，因而提示中枢神经系统可通过自身内源性干细胞来修复，只是由于条件不足而没有足够的新生细胞。最近的研究证实，这些原始NSC数量稀少，且处于静止状态，缺乏特异性形态、表面标志和分化抗原，至今也不能高度纯化分离，很难克隆化4]。因此，外源性NSC移植提供给我们一个大胆的新思路。许多研究表明，NSC移植物在宿主CNS内具有明显的生存、迁移和分化能力，由人胎脑分离的NSC在植入胚胎或新生鼠脑内后，表现为在宿主脑内迁移并进行区域特异性分化，若将相同的人胎脑NSC植入成年大鼠室管膜下区，它们沿吻侧迁移流迁移入嗅球，分化为双极神经元，其分化命运与存留于室管膜下区的内源性NSC相同 [5]。从成年哺乳动物CNS分离的NSC也具有较强的分化潜能，而决定NSC分化命运的主要因素除局部微环境外，还包括NSC的内在特性。如成年动物脊髓NSC植入海马齿状回，能分化为神经元;若植入成年大鼠脊髓则不分化为神经元 [6] ;将从成年动物海马齿状回获得的NSC植入成年大鼠室管膜下区或迁移流后，能分化为嗅球神经元;若植入成年大鼠海马，则产生新的海马神经元 [7，8] 。无论胚胎或成人NSC，在移植入成人CNS非神经发生区后大部分都分化成神经胶质细胞。外源性CSN移植取得了令人鼓舞的成果。Modo等 [9] 给局灶性缺血大鼠移植MHP36鼠干细胞，结果表明，移植的干细胞可增殖分化成神经元细胞，并能显著促进神经功能恢复;Zhang等 [10] 的研究发现，静脉注射骨髓间质细胞可进入脑梗死后的脑实质，并促进新生血管形成。进一步的研究表明，移植的干细胞和骨髓间质细胞可通过分泌生长因子促进内源性神经元再生，促使神经功能恢复。于炳新等 [11] 给局灶性脑缺血大鼠注射重组人粒细胞集落刺激因子，动员自体骨髓造血干细胞。结果表明，脑实质内表达SYN和MAP-2蛋白的增殖细胞显著增加，神经功能缺损明显改善。因此认为，除通过骨髓间质细胞机制外，同时也可能存在骨髓干细胞脑实质内转移，但尚待进一步的研究。
2 转基因技术与NSC
NSC的增殖、分化受自身基因和外来信号(如生长因子)的调控，外来信号首先要与NSC表面的受体相结合，才能将这些信号传至细胞内，从而引起一些与增殖分化相关的基因转录和蛋白质表达。因此，调控外源性NSC的增殖和分化是移植成功并发挥功能的关键。目前可通过转基因技术调控NSC的分化和增殖。将基因导入体外培养的NSC，可用来治疗相应的CNS疾病，其主要目的一是通过导入特定基因调控NSC的增殖和分化;二是通过导入特定基因使NSC定向分化为用于移植治疗所需的特定细胞或表达所需的神经营养因子。NSC可作为理想的基因载体，根据疾病的不同，考虑需要什么部位和具有哪种扩散程度的细胞。目前已采用这一方法进行了部分动物实验。Lacoˉrazza等对Tay-sachs等模型小鼠(先天性脂质代谢异常综合征)将β-氨基己糖苷酯酶α亚单位基因导入C17.2干细胞株进行移植治疗 [12]，该种细胞在植入胚胎鼠和新生鼠脑室后4周，即可发现治疗水平的人β-氨基己糖苷酯酶α在小鼠脑内稳定表达。
3 神经营养因子与NSC
为增强NSC移植后在宿主脑内的功能，近期的研究已不再限于单纯NSC移植。用神经营养因子修饰的NSC移植成为研究热点。由于这些因子本身即可促进神经元成活，因此可延长NSC的成活时间并促进其分化 [13] 。脑源性神经营养因子(BDNF)对NSC的增殖、分化、成活、迁移和脑损伤后NSC的激活等方面具有重要作用，提示通过其他手段增加内源性BDNF合成、释放或通过转染BDNF的NSC移植入宿主缺血坏死的脑区，可通过BDNF的分泌达到优于单纯干细胞移植的目的。
4 NSC移植的影响因素
成功移植NSC不仅要有效控制NSC的分化、增殖，而且要求被移植的细胞在移植部位能成活下来。影响其成活的因素非常多，如分离、纯化、培养过程中的机械损伤、缺氧、缺血或各种必需生长因子的剥夺等，均可影响移植细胞的成活能力与分化潜能;移植区局部微环境中引起神经细胞死亡的各种病理因素，如兴奋性氨基酸毒性、自由基和酸中毒等同样威胁着移植细胞的成活;因此，除了研究避免移植前细胞损伤的保护措施外，深入研究清除移植区的有害因素，造就适合移植NSC的生存环境更为重要。
5 NSC移植的质疑性研究
在利用NSC移植治疗脑血管疾病的研究越来越引起世界各国医生关注的同时，我们也应看到，近两年来，国外一些研究者报道了一系列对NSC移植前期研究结果的质疑性研究。 较早的研究认为，骨髓间质干细胞(mesenchy-mal stem cell，MSC)在体外长期培养的过程中，能始终保持其多向分化潜能，在特定的条件下可分化为多种间质组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞等。因为来源于骨髓的MSC取材容易，便于自体移植，被认为是一种理想的组织工程干细胞。但最近的一系列研究也对此提出了质疑。美国Terada等 [14] 在体外将含有造血干细 胞的骨髓细胞与胚胎干细胞一起培养，产生了预想不到的肌细胞、肝细胞和神经细胞等细胞表型，提示骨髓可能包含有多能干细胞，或在某些条件下可转化为多能干细胞的干细胞;在体外培养一段时间后加入嘌呤毒素(puromycin)以移除胚胎干细胞。但仍可获得胚胎干细胞样细胞，并可进一步分化出多种形态的表型。基因分析显示，这种胚胎干细胞样细胞的基因型是骨髓细胞和胚胎干细胞的混合基因型。这些发现提示，胚胎干细胞与造血干细胞共同培养时，造血干细胞能自发地与胚胎干细胞融合，诱导造血干细胞分化为胚胎样干细胞，呈现为胚胎干细胞的表型特征与相应功能。由此可以认为，已报道的成年组织干细胞分化为与发育上无关的其他系列细胞类型也是这种融合所致。最近美国的Castro和Wagers等 [15，16] 的研究进一步证实，骨髓干细胞在体内不能分化为神经细胞。
6 小结
神经干细胞移植已引起越来越多学者的关注。NSC移植不是对抗神经病变的病理过程，而是通过其潜在的自我修复功能使受损组织得以新生。尽管近年来有些研究对成年组织干细胞可分为其他组织细胞是否定的结果，这并不意味着干细胞疗法研究的终结。至少告诉我们，无论是对胚胎干细胞还是对成年组织干细胞，人们的认识仅仅是初步的。虽然NSC移植在治疗脑血管疾病方面可能存在巨大潜能，但要达到临床应用还有很长的路要走。
参考文献
1 Pincus DW，Keyoung HK，Harrison-Restelli C，et al.Fibroblast growth factor-2/brain-derived neurotrophic tor-associated maturation of new neurons generated from adult human subependymal cells.Ann Neuˉrol，1998，43:576-585.
2 Gross CG.Neurogenesis in the adult brain:death of a dogma.Nat Rev Neurosci，2000，1:67-73.
3 Rietze R，Poulin P，Weiss S.Mitotically active cells that generate neuˉrons and astrocytes are present in multiple regions of the adult mouse hippocampus.J Comp Neurol，2000，424:397-408.
4 Rossi F，Cattaneo E.Opinion:neural stem cell tehrapy for neurological diseases:dreams and reality.Nat Rev Neurosci，2002，3:401-409.
5 Fricker RA，Carpenter MK，Winkler C，et al.Site-specific migration and neuronal differentiation of human neural progenitor cells after transˉplantation in the adult rat brain.J Neurosci，1999，19:5990-6005.
6 Shihabuddin LS，Horner PJ，Ray J，et al.Adult spinal cord stemcells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus.J Neuˉrosci，2000，20:8727-8735.
7 Suhonen JO，Peterson DA，Ray J，et al.Differentiation of adult hipˉpocampus-derived progenitors into olfactory neurons in vivo.Nature，1996，383:624-627.
8 Gage FH，Coates PW，Palmer TD，et al.Survival and differentitation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:11879-11883.
9 Modo M，Stronemer P，Tang E，et al.Effects of implantation site of stem cell grafts on behavioral recovery from stroke damages.Stroke，2002，33:2270-2278.
10 Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.Bone marrow derived endothelial progenitor cells participate in cerebral lariazation after focal cerebral ischemia in the adult mouse.Circ Res，2002，90:284-288.
11 于炳新.重组人粒细胞集落刺激因子在实验性脑缺血中的神经保护作用的初步研究[学位论文].上海:复旦大学附属华山医院神经病学研究所，2003.
12 Magavi SS，Leavitt BR，Macklis JD.Induction of neurogenesis In the neocortex of adult mice.Nature，2000，405:951-955.
13 Andsberg G，Kokaia Z，Bjorklund A，et al.Amelioration of ischemia inˉduced neural death in the rat striatum by NGF-secretingneural stem cells.Eur J Neurosici，1998，10:2026-2036.
14 Terada N，Hamazaki T，Oka M，et al.Bone marrow cells adopt the pheˉ notype of other cells by spontaneous cell fusion.Nature，2002，416:542 -545.
15 Castro RF，Jackson KA，Goodell MA，et al.Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo.Science，2002，297:1299.
16 Wagers AJ，Sherwood RI，Christensen JL，et al.Little evidence for deˉvelopmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.Science，2002，297:2256-2259.
作者单位:300456天津港口医院神经内科
(编辑李 木), 百拇医药(张东菊)